PCR反應(yīng)體系構(gòu)建中引物的設(shè)計(jì)原則
點(diǎn)擊次數(shù)：1451 更新時(shí)間：2020-11-16
引物是PCR反應(yīng)體系構(gòu)建的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上任何一段模板DWA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡桉苷酸鏈做引物,利用PR就可將模板DWA在體外擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系構(gòu)建中引物的設(shè)計(jì)原則：
1、引物長(zhǎng)度:15-30bp ，常用為20bp左右；
2、引物擴(kuò)增跨度:以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段；
3、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ)，不然會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條??；
4、引物堿基:G+C含量以40-60M為宜，G+C 太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGc一般隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或咤啶核苷酸的成串排列；
5、引物3端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失??；
6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列一般有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很友好；
7、引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量以每條引物0.1-1umol或10-100pmo1,以較低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為準(zhǔn)，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
