淺談PCR反應(yīng)體系構(gòu)建設(shè)計(jì)中的重要要素--引物

　　PCR具有突出的優(yōu)勢(shì)，如特異性，靈敏度，高產(chǎn)率，快速，簡(jiǎn)便，可重復(fù)性好，易于自動(dòng)化。它可以在試管中分析待研究的靶基因，或者可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將某個(gè)基因片段擴(kuò)增到十萬(wàn)甚至一百萬(wàn)次，使肉眼可以直接觀察判斷。從頭發(fā)，一滴血甚至是細(xì)胞中提取的DNA都可以擴(kuò)增出足夠數(shù)量的DNA用于分析研究和測(cè)試鑒定。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)舉措和里程碑。因此，PCR反應(yīng)體系構(gòu)建是非常必要的。

　　PCR反應(yīng)的五個(gè)要素：參與PCR反應(yīng)的五種主要物質(zhì)，即引物，酶，dNTP，模板和Mg2+。引物是在PCR反應(yīng)體系構(gòu)建特定反應(yīng)的關(guān)鍵。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物和模板DNA之間的互補(bǔ)程度。從理論上講，只要您知道任何模板DNA序列，就可以設(shè)計(jì)一條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈作為引物，并使用PCR在體外擴(kuò)增模板DNA。
 

　　PCR反應(yīng)體系構(gòu)建設(shè)計(jì)中引物應(yīng)遵循什么原則？

　　1、引物長(zhǎng)度：15-30bp，通常在20bp左右；

　　2、引物擴(kuò)增范圍：200-500bp為宜，具體條件可擴(kuò)增大10kb的片段；

　　3、引物堿基：40％-60％的G+C含量合適，G+C太少，擴(kuò)增效果差，G+C太容易出現(xiàn)非特異性條帶。ATGC是隨機(jī)分布的，避免了5種以上的電子核苷酸嘯叫或字符串排列；

　　4、避免引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩個(gè)引物之間的互補(bǔ)，尤其是3'末端互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體以產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增條帶；

　　5、引物3'末端的堿基，尤其是后一個(gè)和倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格配對(duì)，以避免末端堿基的堿基錯(cuò)配導(dǎo)致PCR失敗。

　　6、引物具有或可以加入合適的限制位點(diǎn)。擴(kuò)增的靶序列應(yīng)具有合適的限制位點(diǎn)。這適合進(jìn)行限制性分析或分子克隆非常有益；

　　7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他序列沒(méi)有明顯的同源性。